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NCB|优秀校友李大力课题组开发超高活性的系列胞嘧啶碱基编辑器（hyCBEs）

来源：校友会 发布时间：2020-05-12 浏览次数： 次 【字体：小 大】
     据 ClinVar 数据显示，人类的遗传病中58%是由于单个碱基突变引起的【1】。虽然Cas9激活的同源重组可以实现对突变位点的精确修正，但效率非常低（ 0.1%~5%）【2】，严重阻碍了其应用。而通过将胞嘧啶脱氨酶与nickase Cas9（D10A）融合而成的胞嘧啶碱基编辑器BE3(Cytosine base editor, CBE), 在不引入 DNA 双链断裂同时也不需要重组修复模板的情况下对编辑窗口（距离PAM远端起的第4-7位）内的胞嘧啶脱氨，实现C>T的碱基转换，具有更加安全、高效、精准的特点【3】。在基因治疗，农作物遗传育种，药物筛选等领域展示了广泛的应用前景【1】。
      自CBE被报导以来，多种策略对其进行了优化改进。例如在提高活性方面，主要是通过密码子优化及增加更强的核定位信号【4】、用高活性的胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A或 Anc689替换 APOBEC1【4,5】、融合额外的 UGI 增加编辑效率和产物纯度【6,7】。而通过对脱氨酶的分子进化获得的evoAPOBEC1-BE4max大幅提高针对GC motif中胞嘧啶的编辑效率【8】。虽然这些方法一定程度上提高了CBE的活性，但是对于编辑窗口的影响不大，特别是更靠近PAM序列的碱基仍然很难被编辑到。因此，是否有新的策略可以提高编辑活性而又能扩增靶向碱基的范围，一直是碱基编辑器优化的难点。
      2020年5月11日，华东师范大学李大力课题组在Nature cell Biology发表了题为Increasing the efficiency and targeting range of cytidine base editors through fusion of a single-strand DNA binding protein domain的研究论文，报道了一系列超高活性的胞嘧啶碱基编辑器（hyCBE），证实其提高编辑效率、扩展编辑窗口的同时保持高效精准的工作性能。
 
       由于CBE主要是以单链DNA（ssDNA）为底物，因此研究团队猜测如果增强脱氨酶与ssDNA的结合能力，是否能增加脱氨酶作用时间而增强活性呢？于是，通过对10个非序列特异性的ssDNA结合结构域（ssDBD）与CBE进行融合，通过筛选，发现将Rad51蛋白的ssDBD融合到APOBEC1与Cas9n之间能显著提高碱基编辑活性，同时编辑窗口也大幅增加（图1）。通过10个靶点的分析，在编辑窗口C4-C8中，hyBE4max比BE4max活性提高了1.5-2倍，而在C9-C15这些更靠近PAM的碱基中，活性最多提高了18倍。







 
图1. hyCBE模式图及对不同ssDBD的筛选结果
 
       为了验证融合ssDBD的策略是否具有通用性，用类似的方法改造A3A-BE4max和特异性识别TC motif中C碱基的eA3A-BE4max, 获得了hyA3A-BE4max 和 hyeA3A-BE4max。通过大量的实验证明，相比A3A-BE4max，hyA3A-BE4max活性在C3-C11位点提高了1.2-2倍，C12-C17位点活性提高3-4倍，通过小鼠胚胎显微注射也进一步证明其在编辑更靠近PAM序列的碱基的独特优势。与eA3A-BE4max 相比，hyeA3A-BE4max仍然能非常特异性地靶向TC motif中的C，编辑窗口由C4-9拓展为C4-15，活性最高提高了 257倍；而在小鼠胚胎中靶向Dmd基因在C13位编辑效率也大大提高，F0小鼠平均编辑活性提高了近60倍，F0代小鼠获得DMD纯合点突变的效率达到40%。
论文进一步验证hyCBEs特别是hyeA3A没有检测到DNA或者RNA层面的脱靶，具有非常高的精准性。最后，通过比较多种CBE在编辑胎儿血红蛋白（HBG1/2）启动子-117位点的能力发现，hyeA3A能在红细胞前体细胞系中精确催化-117G>A的转换，而周围同时发生碱基突变（bystander mutation）的细胞相比，具有更高的HBG表达水平，展示了 hyeA3A-BE4max 对于精准治疗β-血红蛋白病的巨大潜力。该工作开发了能提高编辑活性拓宽靶点范围的一系列新的CBE，为基础研究与基因治疗提供了新的优化工具。
华东师大生命科学学院2016级博士研究生张晓辉，2018级硕士研究生陈亮和2017级博士研究生朱碧云为该论文的共同第一作者，华东师范大学为第一作者单位，李大力教授为本文通讯作者，刘明耀教授对本课题给予了悉心的指导，同济大学毛志勇教授课题组在实验室提供了重要支持。


 
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41556-020-0518-8
 
 
制版人：琪酱

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1.Rees, H.A. & Liu, D.R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet 19, 770-788 (2018).

2.Ran, F.A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc 8, 2281-2308 (2013).

3.Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016).

4.Koblan, L.W. et al. Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction. Nat Biotechnol 36, 843-846 (2018).

5.Wang, X. et al. Efficient base editing in methylated regions with a human APOBEC3A-Cas9 fusion.Nat Biotechnol 36, 946-949 (2018).

6.Komor, A.C. et al. Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity. Sci Adv 3, eaao4774 (2017).

7.Wang, L. et al. Enhanced base editing by co-expression of free uracil DNA glycosylase inhibitor.Cell Res 27, 1289-1292 (2017).

8.Thuronyi, B.W. et al. Continuous evolution of base editors with expanded target compatibility and improved activity. Nat Biotechnol 37, 1070-1079 (2019).

 

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